Bitkilerde Klonlama
Ti plazmit Agrobacterium tumefaciens bakterisinin genetik materyalini bitki hücrelerini enfekte edip bir tümör (taç uru) oluşturmasını ve genetik materyalini bitki hücrelerine aktarmasını sağlayan dairesel bir plazmittir.
Agrobacterium plazmitlerinden birine (A plazmiti) rekombinant DNA tekniğiyle direnç geni aktarılır. Bitki yaprağı kesilerek yaralanma bölgesine agrobacterium bulaştırılır.yaralanan bitki hücrelerinden salgılanan özel bir madde bakterideki diğer plazmiti (B plazmiti) aktif hale geçirir. B plazmiti rekombinant A plazmitinin bitki hücresine geçmesini sağlar.
Agrobacterium ile enfekte bitkilerde tümör oluştuğu görülür. Bakterinin bitkide tümör hücresi oluşturabilmesi için bitkiye bir yapı aktarması gerekmektedir. Bakterinin bitkiye aktardığı yapı Ti plazmidi üzerinde bulunan T-DNA bölgesidir. Bu gen bölgesi bitki kromozomuna entegre olur ve burada ifade olmaya başlar. Öyleyse bir bitkiye gen aktarılmak istendiğinde vektör olarak bu yapı kullanılabilir.
Öncelikle bakteriden plazmidi izole edilir. Plazmidin kesim noktası T-DNA içindedir. Restriksiyon endonükleazla plazmid kesilir. Aynı restriksiyon endonükleazla kesilmiş klonlanacak gen plazmidle aynı ortama konur ve ortama DNA ligaz ilave edilir.
Oluşan rekombinant Ti plazmidleri kültürdeki bitki hücrelerine verildiğinde üzerine klonlanacak geni taşıyan T DNA bitki hücre kromozumuna entegre olur. Bitki hücresinin bölünerek yeni bir bitki hücresi oluşturmasına izin verilir. Oluşan bitkinin her hücresi aynı zamanda klonlanan gen bölgesini içerir.
Bu yöntemle zararlılara karşı dirençli bitki varyeteleri oluşturulabileceği gibi büyüme hormonu ve grip aşısı içeren bitkiler de üretilebilir. Plazmit, 195 protein kodlayan 196 gene sahiptir. Ti plazmid yapısal RNA bulundurmaz. Bu plazmidin değiştirilmesi transgenik bitki üretilmesinde çok önemlidir fakat bu sadece dikotiledon bitkilerde gerçekleştirilebilir.
Ti plazmit genel olarak bitki genomuna entegre olan bir ya da daha fazla T-DNA bölgesi, bir vir bölgesi, bir replikasyon merkezi, konjugatif transferin gerçekleşmesini sağlayan bir bölge ve opin katabolizması için gerekli olan genleri içerirler.
Herhangi bir Ti plazmitinin T-DNA bölgesi sağ ve sol sınır dizilerinin varlığıyla tanımlanır. Bu sınır dizileri 24 bazlık rastgele tekrarlardır. Sınır dizileri arasında kalan herhangi bir DNA, konak bitki genomuna transfer edilecektir. Ti plazmitlerinin nopalin ırkları yaklaşık 20kb büyüklüğünde bir T-DNA bölgesine sahipken, oktopin ırkları 2 T-DNA bölgesi, TL (14kb) ve TR (7kb) içerirler. Sadece TL bölgesi tümör oluşturur, TR bölgesi opin biyosentezi için gerekli genleri taşır.
Nopalin Ti plazmitlerinin T-DNA’sı 13 açık okuma bölgesine (ORF) sahipken, oktopin plazmitlerinin TL T-DNA’sı 8 açık okuma bölgesi içerir. Nopalin T-DNAsı ve oktopin TL T-DNA’sı merkez bölge olarak bilinen bölgede çok yoğun benzerlik gösterirler. Bu bölge hormon biyosentezinde görevli proteinleri, opin sentezinde görevli proteinleri ve tümör büyüklüğünü belirleyen proteinleri kodlar.
T-DNA bölgesi yaklaşık 12-24 kb büyüklüğündedir. Oksin ve sitokinin sentezinde görevli enzimleri kodlayan genleri, ayrıca opin ve agropin olarak bilinen bitki metabolitlerinin sentezinden sorumlu enzimleri kodlayan genleri içerir. Oksin ve sitokinin hormonları, bitki hücresinde büyüme ve gelişmeyi düzenledikleri gibi fazla salgılandıklarında da bitkide tümöre benzeyen oluşumlara sebep olurlar. Opin ve agropinler taç uru içinde sentezlenir ve hücre dışına salgılanır. Bakteri bunları bazen karbon bazen azot kaynağı olarak kullanır.
Ti plazmit üzerinde bulunan opin katabolizması genleri, bakteriye opin alınımı ve parçalanmasında görev alırlar. Bu genler T-DNA bölgesinde bulunmaz, dolayısıyla bitki genomuna aktarılmaz. Ti plazmit üzerinde bulunan vir (virulans) genlerinin ürünleri T-DNA bölgesinin bitki genomuna transferi ve entegrasyonu için mutlaka gereklidir. En az 9 vir-gen operonu bulunmaktadır. Ori bölgesi ise, plazmitin Agrobacterium içinde çoğalması (replikasyonu) için gereklidir.
Biyoteknolojik çalışmaların bitkilere etkisi:
- Virüslere dirençli bitkiler.
- Böceklere dirençli bitkiler.
- Uzun ömürlü bitkiler.
- Tatlı bitkiler. (fieker düzeyi düşük)
- Herbisidlere toleranslı bitkiler.
- Besleyici bitkiler.
- Soğuğa dayanıklı bitkiler elde edilebilir.
